青海專業(yè)團(tuán)隊談PCR擴(kuò)增實(shí)驗室建設(shè)方案與規(guī)劃設(shè)計




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2020-05-15 14:30:42
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PCR實(shí)驗室又叫基因擴(kuò)增實(shí)驗室
。PCR是聚合酶(Enzyme)鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PolymeraseChainReaction)的簡稱
。是一種分子生物學(xué)技術(shù)，用于放大特定的DNA片段
，可看作生物體外的特殊DNA復(fù)制
。通過DNA基因追蹤系統(tǒng)
，能迅速掌握患者體內(nèi)的病毒含量，其精確度高達(dá)納米級別
，精確檢測乙肝病毒在患者體內(nèi)存在的數(shù)量
、是否復(fù)制、是否傳染
、傳染性有多強(qiáng)
、是否必要服藥、肝功能有否異常改變能及時判斷病人最適合使用哪類抗病毒藥物
、判斷藥物療效如何
、給臨床治療提供了可靠的檢驗依據(jù)。
開展PCR實(shí)驗室應(yīng)具備的條件
1
、必須擁有標(biāo)準(zhǔn)的的PCR熒光實(shí)驗（experiment)室;
由于該技術(shù)不僅實(shí)現(xiàn)了PCR從定性到定量的飛躍
，而且與常規(guī)PCR相比，它有特異性更強(qiáng)
、有效解決PCR污染問題
、自動化程度高等特點(diǎn)，目前已得到了廣泛應(yīng)用
。
2
、檢測設(shè)備必須符合標(biāo)準(zhǔn)PCR熒光實(shí)驗（experiment)室設(shè)置要求;
熒光定量PCR儀+實(shí)時熒光定量試劑+通用電腦+自動分析(Analyse)軟件，構(gòu)成PCR-DNA/RNA實(shí)時熒光定量檢測系統(tǒng)
。
3
、必須通過國家臨床檢驗中心的驗收和認(rèn)證;
4、檢測人員必須通過國家臨檢中心業(yè)務(wù)培訓(xùn)并取得合格證書;
PCR實(shí)驗室內(nèi)工作人員必須參加由國家衛(wèi)生部或各省臨床檢驗中心舉辦的臨床基因擴(kuò)增培訓(xùn)班
，并持證上崗
。PCR實(shí)驗室通過驗收，實(shí)驗室至少必須應(yīng)有兩個以上持有“臨床基因檢測上崗證”。PCR實(shí)驗室必須建立嚴(yán)格的實(shí)驗室管理制度
、建立標(biāo)準(zhǔn)化操作程序(procedure)(SOP)
、建立系列質(zhì)量管理文件等，確保實(shí)驗室日常運(yùn)行符合國家衛(wèi)生部的要求
，確保檢測結(jié)果準(zhǔn)確
、確保實(shí)驗室衛(wèi)生安全，確保實(shí)驗室長期穩(wěn)定（解釋:穩(wěn)固安定
；沒有變動)運(yùn)行
5
、必須在無菌(意思:沒有活菌)無塵環(huán)境下進(jìn)行操作
下面介紹如何建立PCR實(shí)驗室
1、建立樣品準(zhǔn)備區(qū)
這個區(qū)域?qū)ｉT用作樣品的準(zhǔn)備
，在制備和操作用于核酸提取的試劑時應(yīng)該采取預(yù)防措施（指針對問題的解決辦法)：
PCR產(chǎn)物和帶有要擴(kuò)增序列的DNA克隆不能在這個房間操作
。
組織培養(yǎng)物、組織標(biāo)本和血清樣品都帶進(jìn)樣品準(zhǔn)備間處理
，以根據(jù)應(yīng)用的需要提取DNA或RNA
。
用于樣品處理的工具不能被用作普通分子克隆的工具，也不能用作操作靶序列
。
DNA樣品應(yīng)該用有專門的防護(hù)或正壓活塞式移液管操作
，以防止在吸取樣品時有氣溶膠遺留。
大體積樣品應(yīng)該用單獨(dú)包裝的無菌(意思:沒有活菌)一次性移液管吸取
。
管子打開前都要簡短離心以減少氣溶膠的產(chǎn)生
，而且管子不能用力崩開，這樣會產(chǎn)生氣溶膠
。
任何時候都應(yīng)該穿實(shí)驗（experiment)服和帶手套
，手套要經(jīng)常更換，尤其在抽提過程中每一步之間都要更換
。實(shí)驗服要專門用于樣品準(zhǔn)備間
，經(jīng)常清洗。
2
、樣品準(zhǔn)備和RNA-PCRRNA-PCR的額外（extra)步驟（procedure)需要額外的樣品操作
，這樣增加了樣品之間污染的機(jī)會?div   id="jpandex"   class="focus-wrap mb20 cf">；瘜W(xué)實(shí)驗室提供化學(xué)實(shí)驗條件及其進(jìn)行科學(xué)探究的重要場所
。其內(nèi)有大量的儀器：鐵架臺、石棉網(wǎng)
、酒精燈等實(shí)驗工具
。通常會配有化學(xué)藥品柜，藥柜里面有常用的化學(xué)藥品
，比如：五水硫酸銅（CuSO4·5H2O
，即膽礬）
，氫氧化鈉溶液，石灰石
，鹽酸等
。為了避免這一問題，反轉(zhuǎn)錄一步可以在樣品準(zhǔn)備區(qū)進(jìn)行
。在RNA-PCR中應(yīng)用UNG以防止污染的方法也有報道
。
3、建立前PCR區(qū)
。生物實(shí)驗P2室主要用于初級衛(wèi)生服務(wù)
、診斷和研究，其實(shí)驗對象的危害等級為Ⅱ級（中等個體危害
，有限群體危害）
，具體定義為“能引起人類 或動物發(fā)病，但一般情況下對健康工作者
、群體、家畜或環(huán)境不會引起嚴(yán)重危害的病源體
。實(shí)驗室感染不導(dǎo)致嚴(yán)重疾病
，具備有效治療和 預(yù)防措施，并且傳播風(fēng)險有限”
。
該去專門用于準(zhǔn)備各種反應(yīng)
，這個區(qū)域必須保持干凈，而且沒有來自克隆和樣品準(zhǔn)備的污染
?div   id="jfovm50"   class="index-wrap">；瘜W(xué)實(shí)驗室提供化學(xué)實(shí)驗條件及其進(jìn)行科學(xué)探究的重要場所。其內(nèi)有大量的儀器：鐵架臺
、石棉網(wǎng)
  、酒精燈等實(shí)驗工具。通常會配有化學(xué)藥品柜
  ，藥柜里面有常用的化學(xué)藥品
  ，比如：五水硫酸銅（CuSO4·5H2O，即膽礬）
  ，氫氧化鈉溶液
  ，石灰石，鹽酸等
  。前PCR區(qū)必須要有試劑和準(zhǔn)備
  ，特別是專門用于前PCR區(qū)的正壓活塞(piston)式移液管。
4
  、PCR實(shí)驗室試劑的操作
  。
所用的所有溶液都應(yīng)該沒有核酸和(或)核酸酶(DNase和RNase)污染
。
所有PCR試劑中使用的水都應(yīng)該是高質(zhì)量的-新鮮蒸餾(still)的去離子水，用0.22μm過濾的
，并且是高壓滅菌（fungus)
。
在20到25貯存的試劑建議加點(diǎn)像疊氮鈉一類的抗微生物劑，在擴(kuò)增試劑或樣品制備試劑中加入0.025%的疊氮鈉不抑制擴(kuò)增反應(yīng)
。
所用試劑都應(yīng)該以大體積配制
，實(shí)驗一下看試劑是否滿意，然后分裝成僅夠一次使用的量進(jìn)行貯存
。
所有試劑和樣品準(zhǔn)備過程中都要使用一次性滅菌的瓶子和管子
。
新配制的試劑在用于準(zhǔn)備新的標(biāo)本之前應(yīng)該加以檢驗。
樣品準(zhǔn)備和前PCR區(qū)所使用的移液管在不使用時都應(yīng)該小心保存
。
5
、在前PCR區(qū)建立PCR混合物。
可以把即刻可用的“主混合物”溶液配好
、分裝并保存在-20或4
，在實(shí)驗（experiment)室只涉及到擴(kuò)增一種或少數(shù)幾種特異序列時這樣做很有用。
如果你的實(shí)驗室使用多套引物
，以致于配制包括所有試劑的單一反應(yīng)混合物不夠經(jīng)濟(jì)
，可以考慮（consider)分裝保存夠一天的PCR成分。
作為一個規(guī)則
，應(yīng)該保存一套陰性
、弱陽性和強(qiáng)陽性對照樣品來分析樣品配制和PCR前過程的效率和潔凈程度。而且
，你也希望通過使用一個已知的弱陽性樣品來驗證(Experimental)你的樣品緩沖液以證明里面不含擴(kuò)增抑制物
。
陰性樣品要與每組樣品同時做，以分析是否存在樣品與樣品之間的污染以及是否存在PCR產(chǎn)物的污染
，陰性對照應(yīng)該包括核酸以外的所有試劑
。
當(dāng)做陽性對照時，有兩個理由決定了應(yīng)該使用最少數(shù)量的核酸
  。
由于必須有對照反應(yīng)
  ，對照模板的特點(diǎn)應(yīng)該予以考慮。
6
  、控制（control)污染的方法
  。
已設(shè)計出很有力的酶學(xué)方法用來消除一種形式的污染—使用UNG，這一技術(shù)能有效地消除由PCR產(chǎn)物引起的污染
  。另一種控制污染的方法是使用紫外線（Ultraviolet rays)
  ，這種方法不能完全消除污染問題，但可以將污染降低幾個數(shù)量級
  。
7
  、后PCR區(qū)PCR完成以后
  ，需要分析樣品并解釋數(shù)據(jù)，應(yīng)該留出一個專門用于反應(yīng)后處理樣品的地方
  。后PCR活動中使用的所用試劑
  、一次性耗材和儀器都必須是專門用于這一目的，決不能把實(shí)驗室這一區(qū)域的試劑或儀器用于任何前PCR活動
  。