西藏專(zhuān)業(yè)團(tuán)隊(duì)談PCR擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)室建設(shè)方案與規(guī)劃設(shè)計(jì)




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2020-05-15 14:30:42
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PCR實(shí)驗(yàn)室又叫基因擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)室
  。PCR是聚合酶(Enzyme)鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PolymeraseChainReaction)的簡(jiǎn)稱(chēng)
  。是一種分子生物學(xué)技術(shù)
  ，用于放大特定的DNA片段，可看作生物體外的特殊DNA復(fù)制
  。通過(guò)DNA基因追蹤系統(tǒng)
  ，能迅速掌握患者體內(nèi)的病毒含量
  ，其精確度高達(dá)納米級(jí)別
  ，精確檢測(cè)乙肝病毒在患者體內(nèi)存在的數(shù)量、是否復(fù)制
  、是否傳染
  、傳染性有多強(qiáng)
  、是否必要服藥
  、肝功能有否異常改變能及時(shí)判斷病人最適合使用哪類(lèi)抗病毒藥物、判斷藥物療效如何
  、給臨床治療提供了可靠的檢驗(yàn)依據(jù)
  。
開(kāi)展PCR實(shí)驗(yàn)室應(yīng)具備的條件
1
  、必須擁有標(biāo)準(zhǔn)的的PCR熒光實(shí)驗(yàn)（experiment)室;
由于該技術(shù)不僅實(shí)現(xiàn)了PCR從定性到定量的飛躍
  ，而且與常規(guī)PCR相比，它有特異性更強(qiáng)
、有效解決PCR污染問(wèn)題、自動(dòng)化程度高等特點(diǎn)
，目前已得到了廣泛應(yīng)用。
2
、檢測(cè)設(shè)備必須符合標(biāo)準(zhǔn)PCR熒光實(shí)驗(yàn)（experiment)室設(shè)置要求;
熒光定量PCR儀+實(shí)時(shí)熒光定量試劑+通用電腦+自動(dòng)分析(Analyse)軟件
，構(gòu)成PCR-DNA/RNA實(shí)時(shí)熒光定量檢測(cè)系統(tǒng)。
3
、必須通過(guò)國(guó)家臨床檢驗(yàn)中心的驗(yàn)收和認(rèn)證;
4
、檢測(cè)人員必須通過(guò)國(guó)家臨檢中心業(yè)務(wù)培訓(xùn)并取得合格證書(shū);
PCR實(shí)驗(yàn)室內(nèi)工作人員必須參加由國(guó)家衛(wèi)生部或各省臨床檢驗(yàn)中心舉辦的臨床基因擴(kuò)增培訓(xùn)班，并持證上崗
。PCR實(shí)驗(yàn)室通過(guò)驗(yàn)收，實(shí)驗(yàn)室至少必須應(yīng)有兩個(gè)以上持有“臨床基因檢測(cè)上崗證”
。PCR實(shí)驗(yàn)室必須建立嚴(yán)格的實(shí)驗(yàn)室管理制度
、建立標(biāo)準(zhǔn)化操作程序(procedure)(SOP)、建立系列質(zhì)量管理文件等
，確保實(shí)驗(yàn)室日常運(yùn)行符合國(guó)家衛(wèi)生部的要求
，確保檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確
、確保實(shí)驗(yàn)室衛(wèi)生安全
，確保實(shí)驗(yàn)室長(zhǎng)期穩(wěn)定（解釋:穩(wěn)固安定；沒(méi)有變動(dòng))運(yùn)行
5
、必須在無(wú)菌(意思:沒(méi)有活菌)無(wú)塵環(huán)境下進(jìn)行操作
下面介紹如何建立PCR實(shí)驗(yàn)室
1
、建立樣品準(zhǔn)備區(qū)
這個(gè)區(qū)域?qū)ｉT(mén)用作樣品的準(zhǔn)備，在制備和操作用于核酸提取的試劑時(shí)應(yīng)該采取預(yù)防措施（指針對(duì)問(wèn)題的解決辦法)：
PCR產(chǎn)物和帶有要擴(kuò)增序列的DNA克隆不能在這個(gè)房間操作
。
組織培養(yǎng)物、組織標(biāo)本和血清樣品都帶進(jìn)樣品準(zhǔn)備間處理
  ，以根據(jù)應(yīng)用的需要提取DNA或RNA
  。
用于樣品處理的工具不能被用作普通分子克隆的工具，也不能用作操作靶序列
  。
DNA樣品應(yīng)該用有專(zhuān)門(mén)的防護(hù)或正壓活塞式移液管操作，以防止在吸取樣品時(shí)有氣溶膠遺留
  。
大體積樣品應(yīng)該用單獨(dú)包裝的無(wú)菌(意思:沒(méi)有活菌)一次性移液管吸取
  。
管子打開(kāi)前都要簡(jiǎn)短離心以減少氣溶膠的產(chǎn)生，而且管子不能用力崩開(kāi)
  ，這樣會(huì)產(chǎn)生氣溶膠。
任何時(shí)候都應(yīng)該穿實(shí)驗(yàn)（experiment)服和帶手套
  ，手套要經(jīng)常更換
，尤其在抽提過(guò)程中每一步之間都要更換。實(shí)驗(yàn)服要專(zhuān)門(mén)用于樣品準(zhǔn)備間
，經(jīng)常清洗
。
2、樣品準(zhǔn)備和RNA-PCRRNA-PCR的額外（extra)步驟（procedure)需要額外的樣品操作
，這樣增加了樣品之間污染的機(jī)會(huì)
。化學(xué)實(shí)驗(yàn)室提供化學(xué)實(shí)驗(yàn)條件及其進(jìn)行科學(xué)探究的重要場(chǎng)所
。其內(nèi)有大量的儀器：鐵架臺(tái)、石棉網(wǎng)
、酒精燈等實(shí)驗(yàn)工具
。通常會(huì)配有化學(xué)藥品柜，藥柜里面有常用的化學(xué)藥品
，比如：五水硫酸銅（CuSO4·5H2O
，即膽礬）
，氫氧化鈉溶液
，石灰石，鹽酸等
。為了避免這一問(wèn)題
，反轉(zhuǎn)錄一步可以在樣品準(zhǔn)備區(qū)進(jìn)行
。在RNA-PCR中應(yīng)用UNG以防止污染的方法也有報(bào)道
。
3、建立前PCR區(qū)
。生物實(shí)驗(yàn)P2室主要用于初級(jí)衛(wèi)生服務(wù)
、診斷和研究，其實(shí)驗(yàn)對(duì)象的危害等級(jí)為Ⅱ級(jí)（中等個(gè)體危害
，有限群體危害），具體定義為“能引起人類(lèi) 或動(dòng)物發(fā)病
，但一般情況下對(duì)健康工作者
、群體、家畜或環(huán)境不會(huì)引起嚴(yán)重危害的病源體
。實(shí)驗(yàn)室感染不導(dǎo)致嚴(yán)重疾病，具備有效治療和 預(yù)防措施
，并且傳播風(fēng)險(xiǎn)有限”
。
該去專(zhuān)門(mén)用于準(zhǔn)備各種反應(yīng)，這個(gè)區(qū)域必須保持干凈，而且沒(méi)有來(lái)自克隆和樣品準(zhǔn)備的污染
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；瘜W(xué)實(shí)驗(yàn)室提供化學(xué)實(shí)驗(yàn)條件及其進(jìn)行科學(xué)探究的重要場(chǎng)所
。其內(nèi)有大量的儀器：鐵架臺(tái)、石棉網(wǎng)
、酒精燈等實(shí)驗(yàn)工具
。通常會(huì)配有化學(xué)藥品柜，藥柜里面有常用的化學(xué)藥品
，比如：五水硫酸銅（CuSO4·5H2O，即膽礬）
，氫氧化鈉溶液
，石灰石，鹽酸等
。前PCR區(qū)必須要有試劑和準(zhǔn)備，特別是專(zhuān)門(mén)用于前PCR區(qū)的正壓活塞(piston)式移液管
。
4
、PCR實(shí)驗(yàn)室試劑的操作。
所用的所有溶液都應(yīng)該沒(méi)有核酸和(或)核酸酶(DNase和RNase)污染
。
所有PCR試劑中使用的水都應(yīng)該是高質(zhì)量的-新鮮蒸餾(still)的去離子水
，用0.22μm過(guò)濾的
，并且是高壓滅菌（fungus)
。
在20到25貯存的試劑建議加點(diǎn)像疊氮鈉一類(lèi)的抗微生物劑，在擴(kuò)增試劑或樣品制備試劑中加入0.025%的疊氮鈉不抑制擴(kuò)增反應(yīng)
。
所用試劑都應(yīng)該以大體積配制
，實(shí)驗(yàn)一下看試劑是否滿意，然后分裝成僅夠一次使用的量進(jìn)行貯存
。
所有試劑和樣品準(zhǔn)備過(guò)程中都要使用一次性滅菌的瓶子和管子。
新配制的試劑在用于準(zhǔn)備新的標(biāo)本之前應(yīng)該加以檢驗(yàn)
。
樣品準(zhǔn)備和前PCR區(qū)所使用的移液管在不使用時(shí)都應(yīng)該小心保存
。
5、在前PCR區(qū)建立PCR混合物
。
可以把即刻可用的“主混合物”溶液配好、分裝并保存在-20或4
，在實(shí)驗(yàn)（experiment)室只涉及到擴(kuò)增一種或少數(shù)幾種特異序列時(shí)這樣做很有用
。
如果你的實(shí)驗(yàn)室使用多套引物
，以致于配制包括所有試劑的單一反應(yīng)混合物不夠經(jīng)濟(jì)，可以考慮（consider)分裝保存夠一天的PCR成分
。
作為一個(gè)規(guī)則
，應(yīng)該保存一套陰性、弱陽(yáng)性和強(qiáng)陽(yáng)性對(duì)照樣品來(lái)分析樣品配制和PCR前過(guò)程的效率和潔凈程度
。而且
，你也希望通過(guò)使用一個(gè)已知的弱陽(yáng)性樣品來(lái)驗(yàn)證(Experimental)你的樣品緩沖液以證明里面不含擴(kuò)增抑制物。
陰性樣品要與每組樣品同時(shí)做
，以分析是否存在樣品與樣品之間的污染以及是否存在PCR產(chǎn)物的污染
，陰性對(duì)照應(yīng)該包括核酸以外的所有試劑
。
當(dāng)做陽(yáng)性對(duì)照時(shí)
，有兩個(gè)理由決定了應(yīng)該使用最少數(shù)量的核酸。
由于必須有對(duì)照反應(yīng)
，對(duì)照模板的特點(diǎn)應(yīng)該予以考慮
。
6、控制（control)污染的方法
。
已設(shè)計(jì)出很有力的酶學(xué)方法用來(lái)消除一種形式的污染—使用UNG
，這一技術(shù)能有效地消除由PCR產(chǎn)物引起的污染。另一種控制污染的方法是使用紫外線（Ultraviolet rays)
，這種方法不能完全消除污染問(wèn)題，但可以將污染降低幾個(gè)數(shù)量級(jí)
。
7
、后PCR區(qū)PCR完成以后，需要分析樣品并解釋數(shù)據(jù)
，應(yīng)該留出一個(gè)專(zhuān)門(mén)用于反應(yīng)后處理樣品的地方
。后PCR活動(dòng)中使用的所用試劑
、一次性耗材和儀器都必須是專(zhuān)門(mén)用于這一目的
，決不能把實(shí)驗(yàn)室這一區(qū)域的試劑或儀器用于任何前PCR活動(dòng)。