宜賓專業(yè)團隊談PCR擴增實驗室建設(shè)方案與規(guī)劃設(shè)計




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2020-05-15 14:30:42
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PCR實驗室又叫基因擴增實驗室
  。PCR是聚合酶(Enzyme)鏈式反應(yīng)(PolymeraseChainReaction)的簡稱。是一種分子生物學(xué)技術(shù)
  ，用于放大特定的DNA片段
  ，可看作生物體外的特殊DNA復(fù)制。通過DNA基因追蹤系統(tǒng)
，能迅速掌握患者體內(nèi)的病毒含量，其精確度高達納米級別
，精確檢測乙肝病毒在患者體內(nèi)存在的數(shù)量
、是否復(fù)制
、是否傳染、傳染性有多強
、是否必要服藥、肝功能有否異常改變能及時判斷病人最適合使用哪類抗病毒藥物
、判斷藥物療效如何
、給臨床治療提供了可靠的檢驗依據(jù)。
開展PCR實驗室應(yīng)具備的條件
1
、必須擁有標準的的PCR熒光實驗（experiment)室;
由于該技術(shù)不僅實現(xiàn)了PCR從定性到定量的飛躍
，而且與常規(guī)PCR相比
，它有特異性更強
、有效解決PCR污染問題、自動化程度高等特點
，目前已得到了廣泛應(yīng)用
。
2、檢測設(shè)備必須符合標準PCR熒光實驗（experiment)室設(shè)置要求;
熒光定量PCR儀+實時熒光定量試劑+通用電腦+自動分析(Analyse)軟件
，構(gòu)成PCR-DNA/RNA實時熒光定量檢測系統(tǒng)。
3
、必須通過國家臨床檢驗中心的驗收和認證;
4
、檢測人員必須通過國家臨檢中心業(yè)務(wù)培訓(xùn)并取得合格證書;
PCR實驗室內(nèi)工作人員必須參加由國家衛(wèi)生部或各省臨床檢驗中心舉辦的臨床基因擴增培訓(xùn)班，并持證上崗
  。PCR實驗室通過驗收，實驗室至少必須應(yīng)有兩個以上持有“臨床基因檢測上崗證”
  。PCR實驗室必須建立嚴格的實驗室管理制度
  、建立標準化操作程序(procedure)(SOP)、建立系列質(zhì)量管理文件等
  ，確保實驗室日常運行符合國家衛(wèi)生部的要求
  ，確保檢測結(jié)果準確
  、確保實驗室衛(wèi)生安全
  ，確保實驗室長期穩(wěn)定（解釋:穩(wěn)固安定；沒有變動)運行
5
  、必須在無菌(意思:沒有活菌)無塵環(huán)境下進行操作
下面介紹如何建立PCR實驗室
1
  、建立樣品準備區(qū)
這個區(qū)域?qū)ｉT用作樣品的準備
  ，在制備和操作用于核酸提取的試劑時應(yīng)該采取預(yù)防措施（指針對問題的解決辦法)：
PCR產(chǎn)物和帶有要擴增序列的DNA克隆不能在這個房間操作
  。
組織培養(yǎng)物
  、組織標本和血清樣品都帶進樣品準備間處理，以根據(jù)應(yīng)用的需要提取DNA或RNA
  。
用于樣品處理的工具不能被用作普通分子克隆的工具
，也不能用作操作靶序列
。
DNA樣品應(yīng)該用有專門的防護或正壓活塞式移液管操作
，以防止在吸取樣品時有氣溶膠遺留。
大體積樣品應(yīng)該用單獨包裝的無菌(意思:沒有活菌)一次性移液管吸取
。
管子打開前都要簡短離心以減少氣溶膠的產(chǎn)生
，而且管子不能用力崩開
，這樣會產(chǎn)生氣溶膠
。
任何時候都應(yīng)該穿實驗（experiment)服和帶手套，手套要經(jīng)常更換
，尤其在抽提過程中每一步之間都要更換。實驗服要專門用于樣品準備間
，經(jīng)常清洗
。
2
、樣品準備和RNA-PCRRNA-PCR的額外（extra)步驟（procedure)需要額外的樣品操作
，這樣增加了樣品之間污染的機會?div   id="4qifd00"   class="flower right">
；瘜W(xué)實驗室提供化學(xué)實驗條件及其進行科學(xué)探究的重要場所
。其內(nèi)有大量的儀器：鐵架臺、石棉網(wǎng)
、酒精燈等實驗工具。通常會配有化學(xué)藥品柜
，藥柜里面有常用的化學(xué)藥品
，比如：五水硫酸銅（CuSO4·5H2O，即膽礬）
，氫氧化鈉溶液
，石灰石
，鹽酸等
。為了避免這一問題，反轉(zhuǎn)錄一步可以在樣品準備區(qū)進行
。在RNA-PCR中應(yīng)用UNG以防止污染的方法也有報道
。
3
、建立前PCR區(qū)。生物實驗P2室主要用于初級衛(wèi)生服務(wù)
、診斷和研究
，其實驗對象的危害等級為Ⅱ級（中等個體危害，有限群體危害）
，具體定義為“能引起人類 或動物發(fā)病
，但一般情況下對健康工作者
、群體
、家畜或環(huán)境不會引起嚴重危害的病源體。實驗室感染不導(dǎo)致嚴重疾病
，具備有效治療和 預(yù)防措施
，并且傳播風(fēng)險有限”。
該去專門用于準備各種反應(yīng)
，這個區(qū)域必須保持干凈，而且沒有來自克隆和樣品準備的污染
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；瘜W(xué)實驗室提供化學(xué)實驗條件及其進行科學(xué)探究的重要場所。其內(nèi)有大量的儀器：鐵架臺
、石棉網(wǎng)
、酒精燈等實驗工具
。通常會配有化學(xué)藥品柜
，藥柜里面有常用的化學(xué)藥品，比如：五水硫酸銅（CuSO4·5H2O
，即膽礬）
，氫氧化鈉溶液，石灰石
，鹽酸等。前PCR區(qū)必須要有試劑和準備
，特別是專門用于前PCR區(qū)的正壓活塞(piston)式移液管
。
4、PCR實驗室試劑的操作
。
所用的所有溶液都應(yīng)該沒有核酸和(或)核酸酶(DNase和RNase)污染
。
所有PCR試劑中使用的水都應(yīng)該是高質(zhì)量的-新鮮蒸餾(still)的去離子水，用0.22μm過濾的
，并且是高壓滅菌（fungus)
。
在20到25貯存的試劑建議加點像疊氮鈉一類的抗微生物劑，在擴增試劑或樣品制備試劑中加入0.025%的疊氮鈉不抑制擴增反應(yīng)
。
所用試劑都應(yīng)該以大體積配制
，實驗一下看試劑是否滿意，然后分裝成僅夠一次使用的量進行貯存
。
所有試劑和樣品準備過程中都要使用一次性滅菌的瓶子和管子。
新配制的試劑在用于準備新的標本之前應(yīng)該加以檢驗
。
樣品準備和前PCR區(qū)所使用的移液管在不使用時都應(yīng)該小心保存
。
5、在前PCR區(qū)建立PCR混合物
。
可以把即刻可用的“主混合物”溶液配好
、分裝并保存在-20或4
，在實驗（experiment)室只涉及到擴增一種或少數(shù)幾種特異序列時這樣做很有用
。
如果你的實驗室使用多套引物，以致于配制包括所有試劑的單一反應(yīng)混合物不夠經(jīng)濟
，可以考慮（consider)分裝保存夠一天的PCR成分
。
作為一個規(guī)則，應(yīng)該保存一套陰性、弱陽性和強陽性對照樣品來分析樣品配制和PCR前過程的效率和潔凈程度
。而且
，你也希望通過使用一個已知的弱陽性樣品來驗證(Experimental)你的樣品緩沖液以證明里面不含擴增抑制物。
陰性樣品要與每組樣品同時做
，以分析是否存在樣品與樣品之間的污染以及是否存在PCR產(chǎn)物的污染
，陰性對照應(yīng)該包括核酸以外的所有試劑。
當(dāng)做陽性對照時
，有兩個理由決定了應(yīng)該使用最少數(shù)量的核酸。
由于必須有對照反應(yīng)
，對照模板的特點應(yīng)該予以考慮
。
6、控制（control)污染的方法
。
已設(shè)計出很有力的酶學(xué)方法用來消除一種形式的污染—使用UNG
，這一技術(shù)能有效地消除由PCR產(chǎn)物引起的污染
。另一種控制污染的方法是使用紫外線（Ultraviolet rays)
，這種方法不能完全消除污染問題
，但可以將污染降低幾個數(shù)量級。
7
、后PCR區(qū)PCR完成以后
，需要分析樣品并解釋數(shù)據(jù)，應(yīng)該留出一個專門用于反應(yīng)后處理樣品的地方
。后PCR活動中使用的所用試劑、一次性耗材和儀器都必須是專門用于這一目的
，決不能把實驗室這一區(qū)域的試劑或儀器用于任何前PCR活動
。