寧夏專業(yè)團隊談PCR擴增實驗室建設方案與規(guī)劃設計




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2021-11-23 06:43:21
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PCR實驗室又叫基因擴增實驗室。PCR是聚合酶(Enzyme)鏈式反應(PolymeraseChainReaction)的簡稱
。是一種分子生物學技術
，用于放大特定的DNA片段
，可看作生物體外的特殊DNA復制
。通過DNA基因追蹤系統(tǒng)
  ，能迅速掌握患者體內的病毒含量
，其精確度高達納米級別
，精確檢測乙肝病毒在患者體內存在的數(shù)量、是否復制
、是否傳染
、傳染性有多強、是否必要服藥
、肝功能有否異常改變能及時判斷病人最適合使用哪類抗病毒藥物
、判斷藥物療效如何、給臨床治療提供了可靠的檢驗依據(jù)
。
開展PCR實驗室應具備的條件
1
、必須擁有標準的的PCR熒光實驗（experiment)室;
由于該技術不僅實現(xiàn)了PCR從定性到定量的飛躍
，而且與常規(guī)PCR相比，它有特異性更強
、有效解決PCR污染問題
、自動化程度高等特點，目前已得到了廣泛應用
。
2
  、檢測設備必須符合標準PCR熒光實驗（experiment)室設置要求;
熒光定量PCR儀+實時熒光定量試劑+通用電腦+自動分析(Analyse)軟件，構成PCR-DNA/RNA實時熒光定量檢測系統(tǒng)
  。
3、必須通過國家臨床檢驗中心的驗收和認證;
4
、檢測人員必須通過國家臨檢中心業(yè)務培訓并取得合格證書;
PCR實驗室內工作人員必須參加由國家衛(wèi)生部或各省臨床檢驗中心舉辦的臨床基因擴增培訓班
，并持證上崗。PCR實驗室通過驗收
，實驗室至少必須應有兩個以上持有“臨床基因檢測上崗證”
。PCR實驗室必須建立嚴格的實驗室管理制度、建立標準化操作程序(procedure)(SOP)
、建立系列質量管理文件等
，確保實驗室日常運行符合國家衛(wèi)生部的要求，確保檢測結果準確
、確保實驗室衛(wèi)生安全
，確保實驗室長期穩(wěn)定（解釋:穩(wěn)固安定；沒有變動)運行
5
、必須在無菌(意思:沒有活菌)無塵環(huán)境下進行操作
下面介紹如何建立PCR實驗室
1
、建立樣品準備區(qū)
這個區(qū)域專門用作樣品的準備，在制備和操作用于核酸提取的試劑時應該采取預防措施（指針對問題的解決辦法)：
PCR產物和帶有要擴增序列的DNA克隆不能在這個房間操作
。
組織培養(yǎng)物
、組織標本和血清樣品都帶進樣品準備間處理，以根據(jù)應用的需要提取DNA或RNA
。
用于樣品處理的工具不能被用作普通分子克隆的工具
，也不能用作操作靶序列。
DNA樣品應該用有專門的防護或正壓活塞式移液管操作
，以防止在吸取樣品時有氣溶膠遺留
。
大體積樣品應該用單獨包裝的無菌(意思:沒有活菌)一次性移液管吸取。
管子打開前都要簡短離心以減少氣溶膠的產生
，而且管子不能用力崩開
，這樣會產生氣溶膠。
任何時候都應該穿實驗（experiment)服和帶手套
，手套要經常更換
，尤其在抽提過程中每一步之間都要更換
。實驗服要專門用于樣品準備間，經常清洗
。
2
、樣品準備和RNA-PCRRNA-PCR的額外（extra)步驟（procedure)需要額外的樣品操作，這樣增加了樣品之間污染的機會
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；瘜W實驗室提供化學實驗條件及其進行科學探究的重要場所。其內有大量的儀器：鐵架臺
、石棉網
、酒精燈等實驗工具。通常會配有化學藥品柜
，藥柜里面有常用的化學藥品
，比如：五水硫酸銅（CuSO4·5H2O，即膽礬）
，氫氧化鈉溶液
，石灰石，鹽酸等
。為了避免這一問題
，反轉錄一步可以在樣品準備區(qū)進行。在RNA-PCR中應用UNG以防止污染的方法也有報道
。
3
、建立前PCR區(qū)。生物實驗P2室主要用于初級衛(wèi)生服務
、診斷和研究
，其實驗對象的危害等級為Ⅱ級（中等個體危害，有限群體危害）
，具體定義為“能引起人類 或動物發(fā)病
，但一般情況下對健康工作者、群體
、家畜或環(huán)境不會引起嚴重危害的病源體
。實驗室感染不導致嚴重疾病，具備有效治療和 預防措施
，并且傳播風險有限”
。
該去專門用于準備各種反應，這個區(qū)域必須保持干凈
，而且沒有來自克隆和樣品準備的污染
。化學實驗室提供化學實驗條件及其進行科學探究的重要場所。其內有大量的儀器：鐵架臺
、石棉網
、酒精燈等實驗工具。通常會配有化學藥品柜
，藥柜里面有常用的化學藥品
，比如：五水硫酸銅（CuSO4·5H2O，即膽礬）
，氫氧化鈉溶液
，石灰石，鹽酸等
。前PCR區(qū)必須要有試劑和準備
，特別是專門用于前PCR區(qū)的正壓活塞(piston)式移液管。
4
、PCR實驗室試劑的操作
。
所用的所有溶液都應該沒有核酸和(或)核酸酶(DNase和RNase)污染。
所有PCR試劑中使用的水都應該是高質量的-新鮮蒸餾(still)的去離子水
，用0.22μm過濾的，并且是高壓滅菌（fungus)
。
在20到25貯存的試劑建議加點像疊氮鈉一類的抗微生物劑
，在擴增試劑或樣品制備試劑中加入0.025%的疊氮鈉不抑制擴增反應。
所用試劑都應該以大體積配制
，實驗一下看試劑是否滿意
，然后分裝成僅夠一次使用的量進行貯存。
所有試劑和樣品準備過程中都要使用一次性滅菌的瓶子和管子
。
新配制的試劑在用于準備新的標本之前應該加以檢驗
。
樣品準備和前PCR區(qū)所使用的移液管在不使用時都應該小心保存。
5
、在前PCR區(qū)建立PCR混合物
。
可以把即刻可用的“主混合物”溶液配好、分裝并保存在-20或4
，在實驗（experiment)室只涉及到擴增一種或少數(shù)幾種特異序列時這樣做很有用
。
如果你的實驗室使用多套引物，以致于配制包括所有試劑的單一反應混合物不夠經濟
，可以考慮（consider)分裝保存夠一天的PCR成分
。
作為一個規(guī)則，應該保存一套陰性
、弱陽性和強陽性對照樣品來分析樣品配制和PCR前過程的效率和潔凈程度
。而且，你也希望通過使用一個已知的弱陽性樣品來驗證(Experimental)你的樣品緩沖液以證明里面不含擴增抑制物
。
陰性樣品要與每組樣品同時做
  ，以分析是否存在樣品與樣品之間的污染以及是否存在PCR產物的污染
  ，陰性對照應該包括核酸以外的所有試劑。
當做陽性對照時
，有兩個理由決定了應該使用最少數(shù)量的核酸
。
由于必須有對照反應，對照模板的特點應該予以考慮
。
6
、控制（control)污染的方法。
已設計出很有力的酶學方法用來消除一種形式的污染—使用UNG
，這一技術能有效地消除由PCR產物引起的污染
。另一種控制污染的方法是使用紫外線（Ultraviolet rays)，這種方法不能完全消除污染問題
，但可以將污染降低幾個數(shù)量級