。
開展PCR實(shí)驗(yàn)室應(yīng)具備的條件
1、必須擁有標(biāo)準(zhǔn)的的PCR熒光實(shí)驗(yàn)(experiment)室;
由于該技術(shù)不僅實(shí)現(xiàn)了PCR從定性到定量的飛躍
,而且與常規(guī)PCR相比,它有特異性更強(qiáng)
、有效解決PCR污染問題
、自動(dòng)化程度高等特點(diǎn),目前已得到了廣泛應(yīng)用
。
2
、檢測設(shè)備必須符合標(biāo)準(zhǔn)PCR熒光實(shí)驗(yàn)(experiment)室設(shè)置要求;
熒光定量PCR儀+實(shí)時(shí)熒光定量試劑+通用電腦+自動(dòng)分析(Analyse)軟件
,構(gòu)成PCR-DNA/RNA實(shí)時(shí)熒光定量檢測系統(tǒng)
。
3、必須通過國家臨床檢驗(yàn)中心的驗(yàn)收和認(rèn)證;
4
、檢測人員必須通過國家臨檢中心業(yè)務(wù)培訓(xùn)并取得合格證書;
PCR實(shí)驗(yàn)室內(nèi)工作人員必須參加由國家衛(wèi)生部或各省臨床檢驗(yàn)中心舉辦的臨床基因擴(kuò)增培訓(xùn)班
,并持證上崗。PCR實(shí)驗(yàn)室通過驗(yàn)收
,實(shí)驗(yàn)室至少必須應(yīng)有兩個(gè)以上持有“臨床基因檢測上崗證”。PCR實(shí)驗(yàn)室必須建立嚴(yán)格的實(shí)驗(yàn)室管理制度、建立標(biāo)準(zhǔn)化操作程序(procedure)(SOP)
、建立系列質(zhì)量管理文件等
,確保實(shí)驗(yàn)室日常運(yùn)行符合國家衛(wèi)生部的要求,確保檢測結(jié)果準(zhǔn)確
、確保實(shí)驗(yàn)室衛(wèi)生安全
,確保實(shí)驗(yàn)室長期穩(wěn)定(解釋:穩(wěn)固安定;沒有變動(dòng))運(yùn)行
5
、必須在無菌(意思:沒有活菌)無塵環(huán)境下進(jìn)行操作
下面介紹如何建立PCR實(shí)驗(yàn)室
1、建立樣品準(zhǔn)備區(qū)
這個(gè)區(qū)域?qū)iT用作樣品的準(zhǔn)備
,在制備和操作用于核酸提取的試劑時(shí)應(yīng)該采取預(yù)防措施(指針對問題的解決辦法):
PCR產(chǎn)物和帶有要擴(kuò)增序列的DNA克隆不能在這個(gè)房間操作
。
組織培養(yǎng)物、組織標(biāo)本和血清樣品都帶進(jìn)樣品準(zhǔn)備間處理
,以根據(jù)應(yīng)用的需要提取DNA或RNA
。
用于樣品處理的工具不能被用作普通分子克隆的工具,也不能用作操作靶序列
。
DNA樣品應(yīng)該用有專門的防護(hù)或正壓活塞式移液管操作,以防止在吸取樣品時(shí)有氣溶膠遺留
。
大體積樣品應(yīng)該用單獨(dú)包裝的無菌(意思:沒有活菌)一次性移液管吸取
。
管子打開前都要簡短離心以減少氣溶膠的產(chǎn)生,而且管子不能用力崩開
,這樣會(huì)產(chǎn)生氣溶膠
。
任何時(shí)候都應(yīng)該穿實(shí)驗(yàn)(experiment)服和帶手套,手套要經(jīng)常更換
,尤其在抽提過程中每一步之間都要更換。實(shí)驗(yàn)服要專門用于樣品準(zhǔn)備間
,經(jīng)常清洗
。
2、樣品準(zhǔn)備和RNA-PCRRNA-PCR的額外(extra)步驟(procedure)需要額外的樣品操作
,這樣增加了樣品之間污染的機(jī)會(huì)
。化學(xué)實(shí)驗(yàn)室提供化學(xué)實(shí)驗(yàn)條件及其進(jìn)行科學(xué)探究的重要場所
。其內(nèi)有大量的儀器:鐵架臺、石棉網(wǎng)
、酒精燈等實(shí)驗(yàn)工具
。通常會(huì)配有化學(xué)藥品柜
,藥柜里面有常用的化學(xué)藥品,比如:五水硫酸銅(CuSO4·5H2O
,即膽礬)
,氫氧化鈉溶液,石灰石
,鹽酸等。為了避免這一問題
,反轉(zhuǎn)錄一步可以在樣品準(zhǔn)備區(qū)進(jìn)行
。在RNA-PCR中應(yīng)用UNG以防止污染的方法也有報(bào)道。
3
、建立前PCR區(qū)
。生物實(shí)驗(yàn)P2室主要用于初級衛(wèi)生服務(wù)、診斷和研究
,其實(shí)驗(yàn)對象的危害等級為Ⅱ級(中等個(gè)體危害,有限群體危害)
,具體定義為“能引起人類 或動(dòng)物發(fā)病
,但一般情況下對健康工作者、群體
、家畜或環(huán)境不會(huì)引起嚴(yán)重危害的病源體
。實(shí)驗(yàn)室感染不導(dǎo)致嚴(yán)重疾病,具備有效治療和 預(yù)防措施
,并且傳播風(fēng)險(xiǎn)有限”
。
該去專門用于準(zhǔn)備各種反應(yīng)
,這個(gè)區(qū)域必須保持干凈
,而且沒有來自克隆和樣品準(zhǔn)備的污染?div id="jfovm50" class="index-wrap">;瘜W(xué)實(shí)驗(yàn)室提供化學(xué)實(shí)驗(yàn)條件及其進(jìn)行科學(xué)探究的重要場所。其內(nèi)有大量的儀器:鐵架臺
、石棉網(wǎng)
、酒精燈等實(shí)驗(yàn)工具。通常會(huì)配有化學(xué)藥品柜
,藥柜里面有常用的化學(xué)藥品,比如:五水硫酸銅(CuSO4·5H2O
,即膽礬)
,氫氧化鈉溶液
,石灰石,鹽酸等
。前PCR區(qū)必須要有試劑和準(zhǔn)備
,特別是專門用于前PCR區(qū)的正壓活塞(piston)式移液管。
4
、PCR實(shí)驗(yàn)室試劑的操作
。
所用的所有溶液都應(yīng)該沒有核酸和(或)核酸酶(DNase和RNase)污染
。
所有PCR試劑中使用的水都應(yīng)該是高質(zhì)量的-新鮮蒸餾(still)的去離子水
,用0.22μm過濾的,并且是高壓滅菌(fungus)
。
在20到25貯存的試劑建議加點(diǎn)像疊氮鈉一類的抗微生物劑
,在擴(kuò)增試劑或樣品制備試劑中加入0.025%的疊氮鈉不抑制擴(kuò)增反應(yīng)。
所用試劑都應(yīng)該以大體積配制
,實(shí)驗(yàn)一下看試劑是否滿意
,然后分裝成僅夠一次使用的量進(jìn)行貯存
。
所有試劑和樣品準(zhǔn)備過程中都要使用一次性滅菌的瓶子和管子
。
新配制的試劑在用于準(zhǔn)備新的標(biāo)本之前應(yīng)該加以檢驗(yàn)。
樣品準(zhǔn)備和前PCR區(qū)所使用的移液管在不使用時(shí)都應(yīng)該小心保存
。
5
、在前PCR區(qū)建立PCR混合物。
可以把即刻可用的“主混合物”溶液配好
、分裝并保存在-20或4
,在實(shí)驗(yàn)(experiment)室只涉及到擴(kuò)增一種或少數(shù)幾種特異序列時(shí)這樣做很有用
。
如果你的實(shí)驗(yàn)室使用多套引物
,以致于配制包括所有試劑的單一反應(yīng)混合物不夠經(jīng)濟(jì),可以考慮(consider)分裝保存夠一天的PCR成分
。
作為一個(gè)規(guī)則
,應(yīng)該保存一套陰性、弱陽性和強(qiáng)陽性對照樣品來分析樣品配制和PCR前過程的效率和潔凈程度
。而且
,你也希望通過使用一個(gè)已知的弱陽性樣品來驗(yàn)證(Experimental)你的樣品緩沖液以證明里面不含擴(kuò)增抑制物。
陰性樣品要與每組樣品同時(shí)做
,以分析是否存在樣品與樣品之間的污染以及是否存在PCR產(chǎn)物的污染,陰性對照應(yīng)該包括核酸以外的所有試劑
。
當(dāng)做陽性對照時(shí)
,有兩個(gè)理由決定了應(yīng)該使用最少數(shù)量的核酸
。
由于必須有對照反應(yīng),對照模板的特點(diǎn)應(yīng)該予以考慮
。
6
、控制(control)污染的方法。
已設(shè)計(jì)出很有力的酶學(xué)方法用來消除一種形式的污染—使用UNG
,這一技術(shù)能有效地消除由PCR產(chǎn)物引起的污染。另一種控制污染的方法是使用紫外線(Ultraviolet rays)
,這種方法不能完全消除污染問題
,但可以將污染降低幾個(gè)數(shù)量級。
7
、后PCR區(qū)PCR完成以后
,需要分析樣品并解釋數(shù)據(jù),應(yīng)該留出一個(gè)專門用于反應(yīng)后處理樣品的地方
。后PCR活動(dòng)中使用的所用試劑
、一次性耗材和儀器都必須是專門用于這一目的,決不能把實(shí)驗(yàn)室這一區(qū)域的試劑或儀器用于任何前PCR活動(dòng)
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